内生细菌EBS05的GFP标记及诱导番茄抗中国番茄黄化曲叶病毒的研究

概括：

生防菌EBS05为樟树内生枯草芽孢杆菌，具有较强的根际定殖能力，对多种植物病原菌有稳定的拮抗活性，其产生的脂肽类抗生素A是诱导烟草抗烟草花叶病毒的有效诱导子，并通过激活SA信号转导途径诱导烟草产生系统性抗病性，显示出良好的生防应用潜力。为进一步明确内生细菌EBS05的生防机制，本研究利用绿色荧光蛋白基因标记技术及抗生素标记方法，研究了菌株EBS05在番茄根面、番茄体内及根际的定殖动态；以番茄品种江薯14为试验材料，采用RT-PCR和Real time PCR技术，研究了菌株EBS05对番茄植株的促生作用及诱导中国番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性。 研究结果如下：1.利用电穿孔法将携带质粒基因的穿梭载体导入菌株EBS05，成功获得表达GFP的标记菌株EBS05-gfp。菌株EBS05-gfp能在番茄根部表面有效定殖。生物学特性测定结果表明，EBS05-gfp的生长曲线、生物膜形成能力及抑菌活性与野生菌株一致；EBS05在番茄植株及根际定殖动态测定结果表明，EBS05能在番茄根部和茎部有效定殖，接种初期在番茄根部和茎部定殖数量逐渐增多，接种后第14天达更高峰。

同时菌株EBS05具有较强的根际定殖能力，用菌浓度为108 cfu/mL的菌悬液灌根2～28 d后，菌株EBS05在土壤中的定殖量始终保持在106 cfu/g·FW以上。2.通过盆栽试验，确定菌株EBS05对番茄植株的促生效果，并初步探究其促生机制。结果表明，EBS05对番茄植株有明显的促生作用，菌株EBS05能诱导扩张蛋白基因的持续增量表达，并且在番茄中，说明EBS05可能通过诱导扩张蛋白基因增量表达来促进番茄植株的生长。 同时，用EBS05灌根后，番茄根际土壤细菌和放线菌数量显著增加，真菌数量在处理前期增加，但在处理后期显著降低，根际土壤脲酶和磷酸酶活性显著提高gfp细菌，说明EBS05对番茄的促生作用可能还与其改变根际土壤微生物区系、提高土壤酶活性有关。3.内生细菌EBS05能有效诱导番茄对中国番茄黄化曲叶病毒的系统抗性，经EBS05诱导处理后，番茄黄化曲叶病毒病发病时间延迟，病害明显减轻，诱导抗病效果达53.60%。4.利用RT-PCR和Real time PCR技术研究了EBS05诱导番茄抗性的信号转导途径。 结果表明，经过EBS05诱导处理，番茄SA信号转导途径下游标记基因NPR1和PR1在攻击接种后第1天被激活并持续表达增加，第7天其相对表达量达到更高峰，与对照相比分别增加了16倍和13倍。推测内生细菌EBS05是通过SA信号转导途径诱导番茄系统性抗中国番茄黄化曲叶病毒的。

同时，在攻击接种后第5天，JA信号转导途径下游的标记基因Coi1被激活并增量表达，表明在EBS05诱导番茄系统抗中国番茄黄化曲叶病毒的信号转导途径过程中，SA信号途径和JA信号途径可能存在交叉协同作用。5.利用RT-PCR研究了EBS05对番茄病程相关蛋白的诱导效果。结果表明，EBS05能诱导番茄PR1，PR2和PR3基因的持续增量表达，并有效激活PR5基因的诱导表达。经EBS05诱导处理后，番茄中β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性显著高于对照，分别在攻击接种后第7和第9天达活性高峰。 6.用比色法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别测定了防御相关酶活性及其同工酶的变化。结果表明，EBS05菌株诱导处理后，番茄超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性显著高于健康对照植株。过氧化物酶（POD）活性在诱导处理后1～5天略有下降，但从诱导处理后第7天开始迅速上升，且其活性值始终显著高于对照。EBS05菌株诱导处理后再进行攻击接种，SOD、POD、PPO和PAL活性均显著高于对照。结合番茄黄化曲叶病毒病病程分析，EBS05菌株诱导处理后番茄黄化曲叶病毒病发病延迟、严重程度减轻与番茄防御相关酶活性的提高有一定相关性。 EBS05能诱导番茄SOD、POD、PPO同工酶的积累并产生新的同工酶带。

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