[doc] 致畸剂检测用gfp基因工程菌的构建.doc

用于检测致畸剂的GFP基因工程菌的构建应用与环境生物学2007,13(1):83-86 (南京农业大学生命科学学院微生物学系/农业部农业环境微生物重点开放实验室，南京)摘要RecA和UvrA是细胞SOS系统中重要的修复蛋白，在细胞DNA损伤后，其表达受到诱导。将报告基因绿色荧光蛋白基因（）置于启动子控制下，构建成质粒和，转化大肠杆菌，构建成检测菌株和。实验发现，菌株和致畸剂经吖啶橙处理后，GFP表达量增加，菌悬液在507nm蓝光激发后产生的绿色荧光明显增强，且与吖啶橙浓度具有一定的相关性，即使在0.5gmL吖啶橙诱导下，也能检测到荧光增强效果。 用对硝基苯酚等各种致畸剂处理的检测菌株均有荧光增强作用。图,,,,&(,e,logy,s,,,China)。

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Fig4、Tab1、(ein);;GEM()过多，导致其在实际应用中受到很多限制。SOS修复系统是生物细胞修复DNA损伤的网络系统，目前发现有30多种蛋白参与这一修复系统，这些蛋白均受抑制剂lexA的调控。当DNA受损时，LexA调控自身及下游30多种其他SOS修复蛋白的表达（图1）。其中RecA和UvrA是SOS系统中研究最多的两种修复蛋白，DNA损伤后它们的表达大大增强。报告基因置于recA和uvrA启动子的调控之下，一旦环境样品中存在致畸剂，通过报告基因表达的强度即可判断致畸剂的含量。将lux报告基因与DNA损伤修复蛋白、热休克蛋白、脂肪酸合成抑制蛋白等作为报告基因，将其置于recA和uvrA启动子的调控之下，构建成Ga6… ?Ga3O图1 SOS修复系统基因网络结构示意图[1.1菌株与质粒1.2培养条件LB培养基每升含、、，用NaOH调pH为7。

2；在固体培养基中添加2%琼脂。 3 重组质粒及试验菌株的构建根据reeA和uvrA基因序列（以reeA和uvrA序列总DNA为模板），用PCR扩增reeA和uvrA启动子片段，并在片段两端设计EcoRI和BamHI酶切位点（酶切位点以下划线部分表示）。扩增reeA启动子的引物为R11（5’-ACTI’AA:SU-3），扩增UvrA启动子的引物为U11（5’-SU-3）和U12（5’-SU-3）。PCR重复30个循环，最后在72 ℃延伸反应10 min。PCR扩增片段和质粒经EcoRI和BamHI双酶切后，用T4 DNA连接酶连接，分别形成质粒和质粒，转化到含有吖啶橙的LB平板中处于感受态。37 ℃培养过夜后开板成菌。所有分子生物学操作按参考文献[9]进行。1.4 致畸剂对菌株的诱导将菌株接种于含氨苄西林的LB液体中，振荡培养过夜。离心收集菌体后，用无菌LB液体洗去残留抗生素gfp细菌，取适量接种于含不同浓度诱导剂的LB液体培养基中继续培养。

每30 min取1 mL菌悬液，100 ℃离心1 min，用pH 7.0 PBS 洗涤2次，以适量体积的PBS 重悬，其光密度J600 在0.1～0.3 之间。1.5 细菌GFP荧光检测条件的确定将上述PBS菌悬液用同样的PBS 稀释成不同的细菌浓度梯度，以无菌PBS 液为空白对照，首先用荧光分光光度计扫描仪(型号：日立850 荧光分光光度计) 扫描激发光谱，测定激发光谱。1.6 细菌GFP荧光的定量检测取3 mL 上述稀释的PBS 菌悬液，立即用荧光分光光度计(型号：上海灵光F96 荧光光度计) 检测荧光强度。 激发(型号：上海灵光722N可见分光光度计)，测定菌悬液吸光度荧光强度与菌悬液吸光度值的比值(J)。假定不加入诱导剂。1.7菌株对不同致畸剂的荧光反应检测。经上述方法诱导后，每隔30分钟检测菌株的相对荧光强度。1.8致畸剂吖啶橙浓度对荧光强度的影响。每隔30分钟检测菌株的相对荧光强度。吖啶橙2.1质粒及工程菌的验证PCR在reeA和uvrA启动子区特异性扩增出约270bp的片段，100%。选取荧光较强的菌株和，提取其质粒，用EcoRI和双酶切处理，消化产物经0.75%凝胶电泳验证(图2)。 与对照PUC19相比，质粒和均多出约1kb的条带，与理论值（770bp+270bp）接近，证明和已成功构建，并在宿主菌Ecoli中表达。 图2 PCR产物及转化子质粒电泳图进行酶切验证